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產品簡介

Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8），是一種基于WST-8而廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速、高靈敏度檢測的試劑盒。

CCK-8試劑中含有WST-8（化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）是一種類似于MTT的化合物，它在電子耦合試劑1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸-二甲酯（1-Methoxy PMS）存在條件下，可以被線粒體內的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產物Formazan （參考圖1），生成的Formazan數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析，細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。

操作步驟

• 制作標準曲線（測定細胞具體數量時）

1. 制備細胞懸液：細胞計數。

2. 接種到 96 孔板中：按比例（例如：1/2 比例）依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做 3-5 個細胞濃度梯度，每組 3-6 個重復孔。每孔約 100μl 細胞懸液。

3. 37℃培養箱中培養：細胞接種后貼壁大約需要培養 2-4 小時，如果不需要貼壁，這

   ^{步可以省去。}

1. 每孔加入 10μl CCK-8 增強型溶液：由于每孔加入 CCK-8 量比較少，有可能因試劑沾在孔壁帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻。或者直接配置含 10% CCK-8 的培養基，以換液的形式加入。注意不要在孔中生成氣泡，以免影響吸光度的檢測。

2. 培養箱內孵育一定時間后測定 450nm 吸光度，制作出一條以細胞數量為橫坐標(X

   軸)，吸光度為縱坐標(Y 軸)的標準曲線。根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量（使用此標準曲線的前提是實驗的條件要一致，便于確定細胞的接種數量以及加入 CCK-8 后的培養時間。）

• 細胞活性檢測

1. 制備細胞懸液：細胞計數。

2. 接種到 96 孔板中：根據合適的鋪板細胞數，每孔約 100μl 細胞懸液，可設置 3 個

   重復孔。

3. 37℃培養箱中培養：細胞接種后貼壁大約需要培養 2-4 小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4. 每孔加入 10μl CCK-8 增強型溶液：由于每孔加入 CCK-8 量比較少，有可能因試劑沾在孔壁帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻。或者直接配置含 10% CCK-8 的培養基，以換液的形式加入。注意不要在孔中生成氣泡，以免影響吸光度的檢測。

5. 培養箱內孵育 0.5-4 小時：細胞種類不同，形成的 Formazan 的量也不一樣，對于大多數情況孵育 1 小時即可。如果顯色不夠的話，可以繼續培養，以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的 Formazan 很少，需要較長的顯色時間（5-6 小時）。

6. 測定 450nm 吸光度：如果暫時不測定吸光度，可以向每孔中加入 10μl CCK-8 反應終止液，遮蓋培養板避光保存在 2-8℃，在 7 天內吸光度不會發生變化；或者可以向每孔中加入 10μl 自己配制的 0.1M HCl 溶液或 1% w/v SDS 溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條

   件下，在 24 小時內吸光度不會發生變化。